Jensen est le fils d'un acteur peu connu, Alan Roger Ackles et de Danna Joan Shaffer. Il a des origines allemande, irlandaise et anglaise, ayant des ancêtres de nationalités différentes et très variées. Jensen a un grand frère et une petite soeur. Il a toujours été très proche d'eux et l'est encore aujourd'hui. Il prend énormément soin de sa petite soeur et a toujours été très protecteur avec elle, principalement à l'école. A l'âge de quatre ans, Jensen pose pour des photographes et il continue sa carrière de "mannequin" jusqu'à l'âge de dix ans. Il obtient son bac en 1996. Au lycée, il jouait au base-ball, à la crosse et ... dans une pièce de théâtre. C'est à cette époque là qu'il a commencé à penser devenir acteur. Son idée se concrétise lorsqu'il commence à prendre des cours d'art dramatique et qu'il s'installe à Los Angeles, pour ne rater aucune chance de percer dans le milieu de la comédie. Il enchaîne les petits rôles sur petit écran, avant d'être de plus en plus connu grâce à son rôle dans Smallville. Rôle qui lui ouvrira les portes de Supernatural et lui permettra de devenir un acteur très adulé par de nombreux fans. Jared Padalecki, son partenaire dans la série qui l'a rendue célèbre, « Supernatural » est devenu son meilleur ami. En mai 2010, Jensen s'est marié avec Daneel Harris, actrice jouant Rachel Gattina dans « Les frères Scott ».

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